血小板自噬与血小板功能的研究进展
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本文将综述血小板自噬对其功能的影响，并进一步讨论血小板自噬的特征及血小板自噬机制在不同疾病中造成的功能性改变。
一、巨核细胞和血小板生成
巨核细胞生成是一个由不同造血细胞和细胞因子介导的复杂过程。成熟的巨核细胞特征是核内有丝分裂、细胞质成熟以及能够产生功能性血小板［6, 7］，可以通过特定的细胞表面标记物识别，包括CD41、CD61、糖蛋白Ⅰb和糖蛋白Ⅴ［8］。转录因子、细胞因子和细胞外应激的参与协同促进巨核细胞的成熟。某些转录因子［如基质细胞因子（SCL）、珠蛋白转录因子1（GATA-1）、红细胞衍生核因子2（NFE2）］可调控巨核细胞/红系祖细胞的发育［9］。蛋白抗体1（FOG1）调节GATA-1的转录活性并有助于巨核细胞的早期分化，而NFE2和SCL调节巨核细胞的后期分化和血小板生成［10］。除了转录因子外，巨核细胞的分化也受到激素，特别是血小板生成素（TPO）的调节［11］。TPO通过与其血小板生成素受体（c-MPL）的相互作用，作为巨核细胞分化和血小板生成的增强因子［11, 12］。由丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和核内转录因子（STAT）组成的下游信号的激活，协同促进造血干细胞向巨核细胞生成。成熟的巨核细胞获得血小板生成的所有必需细胞成分，在脱落之前转变为无核细胞［13］。同时，包括微管蛋白和肌动蛋白在内的细胞骨架发生重排，使前体血小板的巨大伪足突出。最终，这些前体血小板从巨核细胞中释放出来，从而产生循环血小板［14］。从成熟巨核细胞中释放出血小板的过程称为血小板生成。值得注意的是，已有证据表明凋亡参与了血小板释放的最后阶段［15］。
二、血小板自噬的发现和表征
血小板是一种无核细胞，在生理性止血和病理性血栓形成中扮演关键角色。此外，血小板在调控宿主对损伤、炎症和传染病的反应中具有生物学活性［16, 17］。起初在类癌综合征患者中，通过透射电镜发现了血小板内的自噬体样结构，提示血小板自噬机制可能存在［18］。随后在免疫性血小板减少症（ITP）患者中，也发现了血小板自噬的证据，其表现出广泛的细胞质空泡［19］。Jiang等［20］的研究表明，雷帕霉素在大鼠血栓形成模型中以自噬依赖的方式促进了血小板与内皮细胞的黏附。随后，自噬基因转录产物被证实存在于血小板中。2014年，Feng等［21］首次系统阐述了自噬机制在人类血小板中的组成性表达，并证明了自噬是维持血小板基本功能所必需的。通过免疫印迹和免疫细胞化学/免疫荧光技术，可以检测到自噬蛋白复合体的许多成分，包括第三条轻链（LC3）、SQSTM1单克隆抗体、自噬相关蛋白7（ATG7）、ATG12-ATG5复合物和Beclin 1［22］。据报道，人类血小板还表达ULK1复合体和BECN1-PIK3C3复合体的组分，以及溶酶体自噬体融合机制的成分（EPG5和RAB7A）［23］。此外，有学者利用表达绿色萤光蛋白（GFP）融合自噬标记物（LC3、ATG5、BECN1）的转基因小鼠，通过共聚焦荧光显微镜在分离的血小板中证明存在自噬体［22］。使用超分辨率显微镜，显示了用自噬诱导剂雷帕霉素处理的人血小板中LC3的积累，且在巴佛洛霉素A1（Baf A1）处理后LC3的积累更明显［22］。有研究表明，在静息或应激条件下，通过透射电镜可以清晰观察到包裹细胞内容物和细胞器的双膜结构，与自噬体非常类似［24］。从暴露于缺氧条件的小鼠分离的血小板中观察到含有线粒体的自噬体（即线粒体自噬）［24］。此外，对Vici综合征患者（一种罕见且严重的常染色体隐性遗传性疾病，由于EPG5功能缺失突变所致）血小板的分析发现了LC3阳性颗粒的积聚［23］。这一发现表明，Vici综合征患者血小板中的自噬体数量增加，并揭示血小板受到EPG5突变诱导的自噬缺陷的影响，导致晚期自噬体无法清除［23］。综上所述，自噬基因和相关蛋白在人类和小鼠血小板中组成性表达（表1）。
三、自噬对血小板生成及功能的影响
已有大量证据支持自噬在血小板生成中的作用。据报道，自噬抑制剂mTOR复合体-1（mTORC1）可调节巨核细胞发育的早期和晚期阶段［25］。此外，用雷帕霉素抑制mTORC1可诱导自噬，降低巨核细胞的大小和染色体倍性，并通过p21和细胞周期蛋白（cyclin）D3依赖性途径阻碍巨核细胞发育成熟［26］。这些证据表明自噬在巨核细胞发育的调节中起着重要作用。值得注意的是，mTORC1和mTORC2都参与了细胞周期的调节。然而，由于雷帕霉素的药理学非特异性，很难得出自噬直接调控巨核细胞发育的结论。因此，逐渐开发出使用基因敲除小鼠的方法来强调自噬的作用［27］。最近一项研究表明，在造血干细胞中敲除ATG7抑制自噬会导致巨核细胞发育和血小板生成受损，从而产生功能失调的血小板［28］。鉴于这些发现，自噬对于巨核细胞发育的早期阶段可能是不可或缺的，且对于正常血小板功能也是必需的。有研究报道，通过敲除自噬基因抑制K562细胞的自噬阻碍了巨核细胞的形成［29］。同样，拉帕替尼治疗诱导K562细胞的自噬和巨核细胞分化，可通过ATG7的敲除或应用3-MA来抑制［30］。在MO7e细胞中的进一步研究表明，细胞周期和核分裂受mTORC1调控，而细胞大小和细胞死亡受mTORC2调控［21］。
此外，在血小板细胞水平，用PI3K抑制剂抑制自噬信号，或用溶酶体抑制剂Baf Al和氯喹抑制自噬性降解，可明显减弱血小板的聚集和黏附功能［31］。进一步研究证实了PI3K依赖性自噬是维持正常血小板功能所必需的［32］。另一项体内研究显示，在大鼠体内静脉注射R-硫辛酸（一种抗血小板药物）可显著减少大鼠血小板计数，而不影响巨核细胞的数量。此外，大剂量R-硫辛酸导致循环血小板半衰期显著缩短，且血小板中活性氧水平增高，并诱导血小板自噬，该过程由PI3K介导，并可被3-甲基腺嘌呤逆转［33］。该结果提示，PI3K依赖性血小板自噬与循环血小板计数减少和血小板寿命缩短显著相关［33］。
四、血小板自噬与临床相关疾病
1. ITP：ITP是临床上一种常见的出血性疾病，其发病机制主要为自身抗体介导的血小板破坏增多及T淋巴细胞亚群比例失衡［34］。有研究证实血小板自噬与ITP的发病机制显著相关。一项体内研究表明，ITP小鼠的特征是未成熟巨核细胞/血小板的比例增高，且自噬效应增强［19］。该结果可以解释ITP患者外周血血小板计数减少的原因。另一项研究通过ATG7敲除小鼠模型证明自噬机制在巨核细胞生成和血小板功能中扮演关键角色。在ITP患者中，自噬缺失阻碍巨核细胞的形成和分化，导致血小板体积变大、数量减少［28］。通过将MEG-01细胞暴露于从ITP患者或健康志愿者分离的血浆中，观察到仅暴露于ITP血浆的细胞中自噬的诱导，该现象可以被氯喹抑制［35］。另一项研究显示，从ITP患者分离的血小板中自噬受到抑制，相反，通过膜联蛋白Ⅴ表达证明ITP血小板中细胞凋亡水平较高［36］。此外，研究证实ITP中存在的血小板自噬依赖于PI3K-AKT-mTOR途径，用雷帕霉素处理ITP患者的血小板导致其自噬增强，减少血小板破坏，从而提高其生存能力［37］。综上，血小板自噬对ITP的影响主要体现在两方面：（1）自噬缺失阻碍造血干细胞向巨核细胞分化；（2）异常自噬影响巨核细胞向血小板分化。
2. 脓毒症：血小板减少和血小板功能受损与脓毒症引起的器官衰竭有关［38］。研究表明，血小板线粒体自噬参与了脓毒症的多器官衰竭的病理生理过程，自噬可通过维护线粒体完整性和减少细胞凋亡从而保护脓毒症中的宿主细胞［39, 40］。最近研究表明，从脓毒症患者中分离出的血小板表现出自噬流减少，这是由于LC3识别和EPG5结合减少导致自噬的晚期抑制［22］。该过程由脂多糖（LPS）-TLR4信号触发，下游信号转导通过MAPK-ERK-mTOR途径实现，构建起内毒素与血小板自噬的连接桥梁［22］。使用TLR4抑制剂TAK242可抑制LPS诱导的氧化应激，并增强血小板线粒体自噬，从而有效减轻脓毒症小鼠肺和肾损伤［40］。另一项研究证实，盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症导致自噬体的早期清除，但在疾病后期出现SQSTM1的积累［39］。此外，脓毒症动物组织的透射电镜分析确实显示了自噬体的数量增加，但只有少数自噬溶酶体提示在脓毒症某些阶段自噬体和溶酶体融合减少［39］。因此，血小板自噬功能异常可能是脓毒症的潜在治疗靶点。
3. 糖尿病：最近研究报道，从糖尿病患者中分离出的血小板显示出显著的线粒体自噬效应，即通过自噬选择性降解线粒体［24］。该研究证明了血小板线粒体自噬诱导作为一种血小板保护机制。糖尿病患者的高血糖状态导致明显的氧化应激和p53的磷酸化，从而导致线粒体功能障碍和细胞凋亡［41］。该机制反映在从糖尿病患者分离的血小板中，其中血小板线粒体自噬由活性氧物质诱导，并且依赖于JNK激活的信号传导途径［41］。通过线粒体自噬清除受损的线粒体，导致p53磷酸化降低，随后阻止血小板凋亡。在三氯化铁诱导的颈动脉损伤模型中，使用PINK1敲除小鼠抑制血小板线粒体自噬，观察到血管血栓形成增加，该结果进一步强调了血小板自噬作为血小板保护机制的重要性［42］。
五、总结与展望
血小板自噬机制对于维持血小板正常功能至关重要，可在氧化应激、饥饿、缺氧缺血损伤等多种病理生理条件下被诱导。自噬可调控巨核细胞发育分化以及血小板功能，其分子机制主要依赖于PI3K信号的激活。然而，在不同疾病模型中，血小板自噬的效应却不同甚至相反，其具体机制值得进一步探究。此外，血小板自噬在慢性肝病患者（尤其是肝硬化血小板减少症）中对血小板功能的影响尚未有系统性研究，阐明该问题将为治疗慢性肝病相关血小板减少症提供新的理论依据。
引用：杨华湘, 谭明洁, 李扬杰, 等. 血小板自噬与血小板功能的研究进展[J]. 中华医学杂志, 2023, 103(22): 1729-1732.