水稻、小麦和大麦耐盐性突变体的田间预筛选方案
导读
气候变化、耕地减少和人口增长等因素，持续对世界粮食安全构成了持续威胁。如何提高盐渍化障碍导致的中低产田的产能，将一部分盐碱地转化为耕地，是应对耕地安全的有效策略，其关键在于是否能选育出适于盐碱地规模化种植的耐盐作物新品种。本文由 (1)对土壤盐分问题的简介、 (2)测定土壤盐分的方案和(3)筛选耐盐谷类基因型的方案三部分组成。为有需要的作物育种者提供有效、低成本、方便快捷地筛选耐盐谷物群体(如突变群体)的方案。
原文来源：Protocols for Pre-Field Screening ofMutants for Salt Tolerance in Rice, Wheat and Barley
作者：Souleymane Bado • Brian P. Forster •Abdelbagi M.A. Ghanim •Joanna Jankowicz-Cieslak • Gu¨nter Berthold •Liu Luxiang
编译者：中国科学院烟台海岸带研究所 陈小兵、冯红宇、咸敬甜、曹丹、董小燕、李远；江苏省农科院新洋试验站：顾闽峰；江苏沿海地区农科所 沈会权
联系人：陈小兵，xbchen@yic.ac.cn
前言
国际粮农组织与原子能机构合作项目“食品和农业中的核技术”通过研究和培训等方式，支持许多成员国在作物育种和遗传方面应用核技术已超过50年，特别是在开发突变诱导和突变检测方法方面。作物突变诱导旨在为育种者在作物产量、品质、对害虫和疾病的抗性以及对非生物胁迫如耐盐性等方面提供新的遗传多样性资源。作物诱导突变始于20世纪20年代，第一个突变品种是1934年在印度尼西亚发布的“Vorstenland”烟草。作物突变育种技术已经非常成功，至今，在全世界超过210个作物物种中有超过3220个官方公布的突变品种。气候变化、耕地减少和人口增长等因素持续对世界粮食安全构成威胁。因此，作物育种者需要不断研发高产作物品种。作物突变育种技术可帮助解决这些问题。但是，首先是需要一个能筛选出携带所需特征的突变体的方案。这本小册子提供了一个筛选耐盐谷类作物中的突变体简单易行的方案。
这本小册子有三个主要部分组成:(1)对土壤盐分问题的简介；(2)测定土壤盐分的方案；(3)筛选耐盐谷类基因型的方案。这些方案旨在帮助有需要的作物育种者有效、低成本、便于操作地筛选耐盐谷物群体(如突变群体)。
该手册提供了简单快捷的土壤采样和可溶性盐含量分析方法，这两种方法对于后期筛选至关重要。有了这些易于遵循的方案，用户可以快速有效地进行分析。
手册中，提供了简单、快速的方法来筛选水培幼苗的耐盐性。苗期鉴定需要4-6周，可以筛选出数百株幼苗。该检测方法既可用于分离群体、标准品系和品种的筛选，也可用于M2群体和高级突变世代的筛选。提供了所需设备的清单，以及水培硬件和培养液配制。忍受程度是通过与已知的耐盐基因类型的特性比较来确定的。如果需要，还可以进行系统性对照试验(不加盐)，比较在盐和非盐条件下的生长情况。设置了忍耐程度的指标，如叶色、卷叶、叶尖死亡和幼苗死亡。还可以观察到根的损害(生长和褐变)和生物量。该方案最初用于筛选水稻突变群体的盐浓度处理，在增加了通气和盐浓度处理后，已适用于小麦和大麦等作物。该方案已经在来自伊朗、缅甸和越南的材料上进行了测试和验证。
Brian P. Forster
奥地利维也纳
第一章 引言
摘要
在世界许多地方，盐度是制约作物产量的主要非生物胁迫之一。据粮农组织土地和作物营养管理部门估计，地球上超过4亿公顷(6 %)的土地受到害的影响。培育耐盐性是谷类研究人员的一个主要目标，为此需要筛选出耐盐品系。在田间筛选耐盐性是困难的，因为土壤盐分是动态的，盐分水平在土壤剖面中水平和垂直变化，并随时间变化。可以通过在溶液培养系统中进行测试来克服这些环境干扰，在溶液培养系统中测试环境是可控的。
1.1背景
土壤盐碱化影响着全球超过8亿公顷的土地，相当于地球上所有土地的6%以上。在干旱地区种植的1500万公顷土地中，有2%受到盐分的影响。在已灌溉的2.3亿公顷土地中，有20%受盐分影响(Munns, 2005)。灌溉加剧了这一问题，因为灌溉水带来了溶解的盐分，这些盐分沉积在土壤中。历史已告诉我们数个文明是因为灌溉导致的农田盐碱化而崩溃，例如，大约4400-3700年前，古老的美索不达米亚文明(现在伊拉克的一部分)由于土壤盐渍化导致的农作物绝收而消失。苏美里亚的作物记录表明，种植的作物从小麦(对盐敏感)转变为大麦(耐盐)，然后随着土壤盐渍化程度的增加，大麦产量随之下降。由于土地盐渍化，1200年前达到顶峰的维鲁山谷的秘鲁文化被迫退回到高地（Pearce 1987;Jacobsen and Adams 1968)。
没有适当的土壤和盐分管理系统的灌溉不可避免地会导致耕地盐碱化。这是由于由于蒸发和作物蒸腾导致水分流失，土壤中钠、钙、镁和钾的可溶性盐不断增加，通常是以氯化物或硫酸盐的形式。此外，过量的钠(碱度)会促进土壤团聚体的崩解，从而劣化了土壤结构，阻碍了水分运动和根系生长。
盐碱环境通常分为潮湿或干燥两类。潮湿的盐碱生境往往分布在沿海地区，并以盐沼为主。由于这些地区毗邻海洋，它们会受到周期性洪水的影响，因此盐度水平会随着时间的变化而波动。干燥盐碱地通常位于内陆，通常与沙漠接壤(Tal, 1985；Neumann, 1997；Flowers, 2004)。其他类型的盐渍环境包括海滨沙丘，那里的盐雾是盐碱化的一个因素，以及干燥的盐湖。盐碱环境的共同特征是土壤盐分和/或与之相关的水源及特殊动植物。盐渍土中最丰富的盐类是氯化钠(NaCL)和硫酸钠(Na2SO4)，它们可能与镁(Mg)盐有关。
可持续灌溉系统包括一种或多种形式的微咸水(微咸水)淋洗和排泄。淋洗可以通过自然降雨和径流实现，或者通过淡水灌溉和人工排水系统实现。在这两个系统中，都需要提供排水系统。这些可能是自给农业社区的小规模项目，也可能涉及大型土木工程项目，如巴基斯坦印度河西岸排水系统(Khan et al, 2013)还需要设计种植制度，以最大限度地利用季节性条件，例如利用季风降雨淋洗盐分和早熟作物，以规避高含盐期。
随着人口的增长，对食物的需求也在增长。在世界各地，最好的农业用地已经得到充分利用，因此包括盐碱地在内的边际性土地正在被用于农业。不幸的是，大多数作物对盐敏感(甜土植物)。因此，土壤盐渍化是全世界作物生产的主要环境限制因素。
1.2耐盐生物学
耐盐植物已经从植物界的许多分类群中进化出来。Aronson(1989)注意到100多个包含耐盐物种的植物科。大多数植物科都有少数耐盐物种(盐生植物)，但藜科是个例外，有350多种。有人提出，许多高等植物的耐盐性是在河口发育的结果(O‘Leary and Glenn，1994)，然后传播到内陆环境。超过30%的现存植物科有盐生植物成员(约2500种)，主要分布在盐沼或沙漠平原(Glenn, 1997)。
Unga(1991)将喜盐植物定义为耐受相对较高的土壤盐分，并能够积累相对较高数量的钠和氯的植物；另一方面，糖藻被定义为对根区盐分水平升高几乎没有耐受性的物种，并且不会在生长组织和器官中积累高浓度的盐分。极端盐生植物如海蓬子和碱蓬能耐受高于海水的咸水，而糖藻则不能耐受高于10%的海水盐度。
通常，在盐环境中生长的植物采用三种生理机制:(1)渗透调节，(2)离子排斥和(3)组织对积累离子的耐受性。盐度的影响首先通过植物生长的减少观察到(Munns,1993)，其具有两个响应阶段:(1)对外部渗透压增加的快速响应(渗透阶段)，一旦根周围的盐浓度增加到阈值水平(对于大多数植物大约40 mM NaCl)就开始，和(2)有害离子在叶中积累的较慢响应(离子阶段)。当老叶的死亡率大于新叶的产量时，光合作用能力将不再是最佳的，生长速度将减慢(Munns and Tester, 2008)。
盐胁迫的这些主要机制(渗透胁迫、离子排斥和组织耐受性)及其组成部分(离子区室化、离子转运、毒性等)存在遗传变异。遗传变异不仅存在于物种之间，也存在于物种内部。前者对植物育种者来说是个好消息，因为它允许通过正常的杂交育种转移耐盐特性，而种间杂交可以提供一种将基因从一个物种(供体)转移到另一个物种(受体)的方法。
1.3筛选方法
植物生长对盐度的反应随植物生命周期而变化；对盐敏感的关键阶段是发芽、幼苗定植和开花(Ashraf and Waheed 1990; Flowers 2004).评估和筛选作物耐盐性的标准根据盐胁迫的水平和持续时间以及植物发育阶段而变化(Shannon 1985; Neumann 1997).一般来说，与非胁迫条件相比，根据生物量生产或产量来评估对盐胁迫的耐受性。在低至中等盐度的条件下，基因型的生产能力通常是最相关的量度，而存活能力通常在相对高的盐度水平下使用(Epstein et al. 1980)。在维持基因型生产能力中起主要作用的生理机制与那些有助于在极高盐浓度下耐受的生理机制不同。
基因型通常使用表型观察来评估。表型选择参数包括:
(a)发芽
发芽试验很容易进行，在作物需要在含盐条件下发芽和生长的情况下，发芽试验可能很重要。然而，含盐条件下的萌发通常与随后生长阶段的耐盐性无关(Dewy 1962; Shannon 1985; Flowers 2004)。
(b)植物存活
基于高盐浓度下植物存活的选择已被提议作为番茄、大麦和小麦的选择标准(Rush and Epstein，1976; Espstein and Norlyn，1977)。无论中等盐度水平下的产量潜力如何，基因型在非常高的盐度下存活并完成其生命周期的能力被认为是绝对意义上的耐受性。
(c)叶片损伤
由于大多数作物是甜土植物，它们不能限制有毒的盐离子从根部转移到枝和叶中。因此，通过叶片漂白和坏死的症状可以很容易地观察到盐分的损害。因此，通过叶片损伤筛选耐盐性是常见的(Richards et al.， 1987; Gregorio et al.， 1997)。
(d)生物量和产量
对于植物育种者来说，产量和生物量是评估耐盐性的直接参数(Richards et al, 1987)。然而，这些参数并不提供有关潜在生理机制的信息。过去，植物育种者对生理机制不感兴趣，认为一个基因型是耐性的就足够了，生理机制被认为是学术的。然而，随着基因功能研究的出现，这种观点正在改变。
(e)生理机制
可以利用提高耐盐性的生理机制进行筛选。这些可能包括测量组织中的钠含量、离子辨别和渗透调节。也可以使用碳同位素识别(δ13C)等给出植物胁迫一般指示的替代物(Flowers and Yeo， 1981；Pakniyat et al.,1997 )。
1.4耐盐育种
1.4.1传统育种
Subarao and Johansen(1994)在启动作物遗传改良方案时提出了下列务实的考虑：
1.定义目标环境。
2.定义必要的改进水平。
3.定义成长阶段响应。
4.选择筛选方法。
5.选择选择标准。
6.评估所考虑的各种性状的基因变异，这些性状可能在提高耐盐性方面发挥作用。
7.确定耐盐性各种成分(性状)的遗传资源。
8.确定所考虑性状的遗传基础，并估计它们的遗传率。
9.启动育种计划，将不同来源的各种性状结合到适应当地的种质中，最终培育出耐盐品种。
10.在生产环境中的一系列含盐土壤中的目标位置测试选定的基因型，以评估它们作为新品种的潜在适应性。
作为比较，Flowers and Yeo(1995)提出了培育耐盐作物的五种策略:
1.开发自然耐受的物种(盐生植物)作为替代作物。
2.利用种间杂交提高当前作物的耐受性。
3.利用作物基因库中已经存在的遗传变异。
4.通过使用轮回选择、突变诱导和/或组织培养在现有作物中产生变异。
5.繁殖是为了产量而不是耐性。
利用传统的杂交育种提高耐盐性的方法收效甚微。这在很大程度上是因为育种材料的初级基因库中不存在所需的耐盐性。对于许多作物物种来说，耐盐性特征不存在于次级基因库中(在物种内)，对于一些作物育种者不得不求助于涉及野生物种的种间和属间杂交，以利用可能通过有性繁殖和重组转移的基因。因此，需要产生新的遗传变异。
1.4.2耐盐育种中的诱变
诱变是增加作物生物多样性的一种方法。通过对植物材料(通常是种子)进行γ射线或X射线照射，可以在几分钟内实现突变诱导。通过使用化学试剂也可以很容易地产生突变。携带所需变异的突变体的检测更费时，通常包括从表型(对盐度的反应)或基因型(寻找目标基因的变化)上筛选数千个个体。筛选所需的突变体通常是作物改良的主要瓶颈。
一旦找到所需的突变体，这些突变体可以直接进入育种程序。然而，更常见的是，在进入育种程序之前，进行一些预育种以“清理”突变品系的遗传背景。各种遗传标记技术可用于标记辅助选择以提高育种效率。
1.5需要可靠的筛选技术进行预选
盐渍化土壤可分为三类：(1)盐质土、(2)钠质土和(3)盐化钠质土。土壤盐分会降低土壤中水分的有效性，并对特定的植物过程产生有毒影响。测土壤盐分的测定是困难的，因为它随着空间和时间的变化而变化。因此，必须在不同地点、不同时间对土壤进行采样，以分析盐分对植物生长的影响。需要大量的样本才能完全描述特定的田块，采样应遵循所有条件的变化；因此，在许多情况下，土壤采样需要花费相当长的时间和精力。
非生物胁迫耐受性，尤其是盐胁迫，是复杂的，因为在生命周期的不同阶段其敏感性不同。水稻在发芽、活跃分蘖(营养生长)和成熟后期对盐胁迫相对耐受。它在幼苗定植和繁殖阶段最为敏感。在早期生长阶段(2-4周)进行筛选比开花期更方便。这是因为它(1)快速、(2)幼苗占用更少的空间、(3)可以回收耐受的幼苗用于种子生产，以及(4)幼苗测试在时间和成本方面更有效。幼苗筛选提供了在大规模田间评价之前预选假定的个体突变体、突变体群体、育种品系和后代以及栽培品种的可能性。
这本小册子中描述的水稻秧苗试验是对最初与国际水稻研究所(IRRI)合作设计的试验的改编。然而，目前的系统不使用浮动支撑，其设计是稳健的、可重复利用的和多功能的；它可以被适应于评估单个基因类型或大的突变群体。水培装置使用带有紧固聚氯乙烯(PVC)支撑板(平台)的塑料水箱。原型系统使用笨重的泡沫塑料支架，但这些支架很难维护，随着时间的推移变得脆弱，并易被藻类和其他微生物污染。聚氯乙烯支架更坚固，易于清洁，只需最少的维护即可重复使用。聚氯乙烯平台也足够坚固，可以支撑数百棵幼苗。测试速度很快，需要4-6周。水稻使用简化的无通气系统，但小麦和大麦幼苗的筛选采用强制通气和较高的盐浓度。
第二章 目标
摘要
盐分影响土壤、水和农作物。需要确定土壤含盐量的严重程度，以便对最佳种植做法做出明智的决定。同样，作物品种的耐受性需要与生长条件相匹配。因此，需要制定监测田间盐度和评估作物耐盐性的方案。
2.1监测现场盐度
土壤盐分会影响水的可用性和植物的生长过程。盐度是指土壤中存在一种或多种溶解的无机离子(Na+、Mg2+、Ca2+、K+、SO42+、HCO3-、NO3-和CO32-)。监测土壤盐分和绘制土壤盐分图是进行良好管理盐渍化土地和耐盐作物品种的生产性农业的基本目标。
2.2 耐盐性筛选
其目的是提供一种筛选方案，在其中可以选择耐盐的水稻、小麦和大麦品系用于作物育种。该筛选也可用于比较和分类一系列种质的耐盐性。原子能机构的植物育种和遗传实验室(PBGL)利用已知对盐碱地条件敏感/耐受的水稻基因型进行了广泛的测试。幼苗的水培反应与田间耐盐性之间存在一定的相关性。因此，这里描述的幼苗筛选可以用来选择在盐渍化条件下可能表现良好的植物。
2.3 种苗筛选的利与弊
本书中描述的方案使用幼苗作为测试材料。苗期对盐的耐受性与田间表现相关（Zeng et al,，2003），在第4章给出的测试案例中（表4.6、4.7和4.8），根据植物在高盐浓度下的存活率进行选择已被提议作为几种作物物种的选择标准（Rush and Epstein，1976；Epstein and Norlyn，1977）。然而，幼苗筛选应被视为一种预筛选，候选品系应始终通过在盐碱地条件下的表现来验证。开花期通常被认为是对盐敏感影响的阶段，在这些方案中没有考虑。然而，水培系统可以适用于测试包括开花和成熟阶段在内植物的整个生命周期。表2.1中列出了水耕法筛选耐盐性的优点和缺点。
幼苗测试最好在M3或高级种群上进行。可以在M2种群上进行测试，其优点是具有相对较小的种群规模，但是存在由于其他因素(例如意外的误操作)而丢失具有耐盐性的稀有突变品系的风险。M3种群和以上种群提供了更多的严格性，因为携带相同突变性状的基因型存在一定程度的复制。
这本小册子中描述的耐盐性测试很简单，可以监测幼苗的响应；它们不涉及对所涉及的生理机制的深入理解。以下参考文献涵盖了耐盐性的生理学方面:
•Ashraf and Waheed (1990), Dewy (1962), Flowers (2004), Shannon (1985)—植物生命周期(从萌芽到成熟)中的植物生长响应
•Shannon (1985), Neumann (1997), Epstein et al. (1980)—测定盐胁迫的标准
•Parida and Das (2005), Munns and Tester (2008)—对植物的影响和耐盐机制
第三章 测量土壤盐度的方案
摘要
描述了一种简单的测试土壤含盐量的方法。从土壤样品中提取水溶性盐，并测定盐分含量。准确的田间评估需要在不同的田间位置和不同的深度取样，并随着时间的推移考虑将要种植的作物种类。制备土壤水浸提液和测量盐含量中列出了仪器和试剂。测量盐含量有两种方法，重量法和电导率法。
3.1背景
土壤含盐量的测量对植物耐盐性研究非常重要。最常用的方法是简单的田间试验。盐碱地区的特点包括微地形、复杂的土壤类型和差异显著的当地土壤条件。为了减少因当地土壤条件的差异而造成的测试误差，需要大量的样品，并且需要重复采样。土壤样品应根据植物种类的根系生长情况，从不同深度的土层采集。对于深根性植物，需要从0至5厘米、5至10厘米、10至20厘米、20至40厘米、40至60厘米等土层取样，深度至少为1米，不同土层的样品应均匀混合。对于根系较浅的植物，土壤层应取样到60厘米左右的深度。盐碱地的含盐量是动态的，随着时间的推移而变化，并且在不同的地方是异质的。它还会随着年份和月份的变化而变化，甚至在一天之内也会变化。考虑到季节和气候条件，采样时间应包括盐分容易积累的春季和夏季，以及雨水容易从土壤中淋洗盐分的秋季和冬季。还应考虑生长季节、播种时间、育苗时间、开花时间和收获时间，因为根据作物的不同，某些生长阶段对盐害可能比其他阶段更敏感。多年来收集的数据对于评估盐渍化的趋势也很有用。
盐碱地拥有过多的可溶性盐分。测量可溶性盐分有两个主要步骤。(1）根据特定的水/土比例制备样品溶液；（2）分析土壤样品中的土壤盐浓度和离子成分。一般来说，对土壤中水和盐含量动态变化的研究使用5:1的水/土比例，而对钠质土的分析一般使用1:1的水/土比例。饱和泥浆很少使用，因为这种方法的执行很繁琐，而且很难确定正确的饱和点。以下测试中的样品溶液是指5:1的水/土壤浸提液。
3.2仪器和试剂
仪器：往复式振动台、1/100天平、布赫纳漏斗、真空泵、离心机（4000r/min），气体提取瓶。
试剂：0.1%的NaPO3。
3.3制备5:1的水/土壤浸提液
称取100 g风干的土壤样品，通过1 mm的筛子。将土壤样品放入锥形瓶中。加入500毫升不含二氧化碳的蒸馏水(水/土比为5:1)。用橡皮塞密封烧瓶口，将锥形瓶放入往复式摇床中，摇动3分钟。摇动后，立即用布氏漏斗进行空气泵过滤。将澄清液体收集在500毫升的锥形瓶中。每25毫升加入1滴0.1 %的NaPO3。
3.4制备1:1的水/土壤浸提液
称量通过1 mm筛子的风干土壤样品。将土壤样品放入锥形瓶中。按1:1的水/土比加入无二氧化碳的蒸馏水。其余操作同上。
3.5重要注意事项
•当以5:1的水/土比例进行提取时，由于水的比例很高，可以忽略空气干燥土壤的吸湿水。当用1:1的水/土比例进行提取时，必须对风干土的吸湿水进行修正，以避免测试误差（与5:1的水/土比例相比，土壤中的吸湿水可能会影响1:1的水/土比例；这需要进行修正以避免测试误差，因此推荐使用完全风干的土壤）。
•在提取土壤中的水溶性盐的过程中，3分钟的摇动足以使水溶性氯化物、碳酸盐和硫酸盐溶解在水中。随着摇动时间或静置时间的延长，中性盐和水不溶性盐也将进入浸提液中，并导致更大的误差。
•空气中CO2的分压和蒸馏水中溶解的CO2都会影响包括CaCO3、CaSO4和MgSO4在内的一些盐的溶解度。因此，提取物中的盐含量会受到影响。因此，提取时必须使用不含二氧化碳的蒸馏水。
•样品溶液的静置时间不应超过1天。
•在土壤浸提液中加入少量NaPO3溶液可以防止静置时形成CaCO3沉淀。虽然NaPO3会略微增加提取液中的Na+浓度，但是NaPO3引起的误差比CaCO3沉淀引起的误差小得多。
3.6测定
测量土壤样品中水溶性盐总量的主要方法有(1)重量法和(2)电导率法。重量法所得数据可靠，但操作繁琐费时。电导法很简单。
3.6.1重量法
这种方法基于从土壤样本中提取的水。将提取物蒸发至干，然后在105–110°C下干燥至恒重。总的干燥残余物包含水溶性盐和水溶性有机物。H2O2用于去除残渣中的有机物。剩下的是土壤中的全部水溶性盐。
3.6.1.1仪器和试剂
仪器:蒸发皿、水浴、干燥器、电热干燥箱、分析天平。
试剂:15 % H2O2和2 % Na2CO3。
3.6.1.2方法
从已知重量(w)的土壤样品中提取50.0 ml溶液，置于蒸发皿中并称重(w0)。在水浴中蒸发至干，然后在105–110°C的电热干燥箱中干燥4小时。从干燥箱中取出，放入干燥器中30分钟，然后使用分析天平称重。将样品放回电热干燥箱中2个多小时，冷却并重新称重。重复这些步骤，直到获得恒定重量(w1)；两次的重量差不应超过1毫克。计算干燥残渣的重量。
滴加15 % H2O2以润湿残留物。在水浴中蒸发至干。重复这种处理，直到整个残留物变白。根据上述方法将白色残渣干燥至恒重(w2)。计算土壤中总水溶性盐的含量。
3.6.1.3水溶性盐总量的计算
其中w是所抽取的提取物相当于土壤样品的重量（g）。
3.6.1.4重要注意事项
•提取的土壤浸提液的体积由土壤含盐量决定。当土壤含盐量高于0.5 %时，抽取25ml；当土壤含量低于0.5 %时，抽取50或100毫升。确保测得的总盐含量为0.02–0.2克
•如果残渣含有高含量的CaSO4 2H2O和MgSO4 7H2O，在105–110°C下干燥不能完全去除这些水合盐中的结晶水。因此，很难获得恒定的重量。在这种情况下，干燥温度应提高到180摄氏度。
•如果土壤中含有大量的CaCl2 6H2O和MgCl2 6H2O，即使在180°C的温度下干燥也很难获得令人满意的结果，因为这些盐极易吸水(容易吸收水分)。在这种情况下，首先添加10毫升2 %的Na2CO3。这将在蒸发至干燥时产生NaCl、Na2SO4和MgCO3盐。加入的Na2CO3的量应从总盐量计算的结果。
•由于许多盐从空气中吸收水分，冷却和称重的条件应该相同。
•当使用H2O2去除有机物时，残留物只需要是湿的。过多的H2O2会产生过多的泡沫，因为H2O2会分解有机物事。这可能会导致盐的飞溅和流失。建议用少量H2O2反复治疗。
3.6.2电导法
土壤中的水溶性盐类作为强电解质发挥作用。因此，土壤溶液具有可以测量的导电性。电导率反映了土壤溶液的导电能力，在一定浓度范围内，土壤中的盐含量与电导率呈正相关。但它不能反映混合盐组成的成分。如果土壤溶液中不同盐类的比例相对恒定，用电导率确定的盐浓度是非常准确的。电导率法是测量土壤含盐量的一种快速而准确的方法。目前的趋势是用电导率直接表示土壤中的总盐含量。电导率的SI单位是siemens per metre (S/m)。
3.6.2.1工具
电导率仪、温度计，温度范围为1至60摄氏度。
3.6.2.2方法
从已知量的土壤中浸提20-30ml样品溶液，并置于烧杯中。根据用户手册调整电导率仪。指针稳定后，读取电导率(mS)值。每10分钟测量一次样品溶液的温度。
3.6.2.3计算
土壤浸提液在25°C时的电导率(EC25)用于反映土壤含盐量。其计算方法如下:
其中EC25是土壤提取物在25°C时的电导率，ECt是土壤提取物在t°C时测得的电导率，ft是t°C时电导率的修正值(见表3.1).
此外，当土壤浸提液的温度为17–35°C时，土壤提取物温度与标准温度(25°C)之差每增加1°C，土壤浸提液的电导率增加或减少约2 %。
当土壤浸提液温度为17–35°C时，土壤浸提液在25°C时的电导率也可根据以下公式计算:
EC25 = ECt × [1 — (t — 25) × 2 %]
其中EC25是土壤浸提液在25°C时的电导率，ECt是土壤浸提液在t°C时测得的电导率，t°C是土壤提取物的温度(°C)。
3.6.2.4重要注意事项
•在电极插入溶液后，每个样品的测量时间应该相对恒定。
•用于电导率测量的溶液应该是透明的。不要使用液体悬浮液，因为这将损坏铂电极上的铂背层，并导致测试错误。
•高电导率的溶液应在测量前稀释。高浓度的溶液会使电极极化，降低仪器的灵敏度。
第四章 水稻耐盐性筛选方案
摘要
提出了一个测试水稻幼苗耐盐性的简单方案。该方法以玻璃温室水培试验为基础，将盐加入到培育秧苗的营养水培液中。提供了一份设备清单，包括水培硬件和溶液配制方案。对使用前的种子储存和促进试验样品均匀发芽的发芽前处理提供了建议。盐处理在水培幼苗定植后，在2-3叶阶段开始进行。给出了标准基因型（耐受型、中间型和敏感型）的反应信息，与试验苗进行比较。盐分胁迫的目测症状包括叶面积减少、下部叶片发白、叶尖死亡、叶片滚动和幼苗死亡。根据国际水稻研究所（IRRI）开发的标准评估系统进行评分。推荐的试验盐浓度与恢复选定的幼苗的方法和使用实例一起给出。
4.1介绍
水稻是最重要的作物之一，世界上一半以上的人口都食用水稻。土壤盐渍化是限制水稻生长的一个主要且日益严重的问题，并导致每年巨大的产量损失。寻找耐盐性提高的新品种是缓解这一问题的主要目标。这个方案提供了一个易于遵循的程序来选择耐盐水稻品系，用于随后的田间试验。
4.2装备
所有设备(水槽、托盘、容器、圆桶和平台)都是深色的，以尽量减少光线透入培养液，从而减少藻类生长。
·试验槽。这些是由塑料制成的，外部尺寸为60 × 40 × 12厘米，装满后每个大约有24升（图4.1）。水箱的大小可以改变，以适应当地条件。
·回收箱。这些是由塑料制成的，外部尺寸为40 × 30 × 17厘米。这些容器可容纳约20升。
·发芽盖:PVC盖用于遮挡光线；这些位于PVC支撑平台上，在发芽期间提供黑暗(不是必须的)。发芽盖尺寸:50 ×34 ×2厘米(图 4.1b)。盖子通过帮助保持湿度和温度并隔绝光线来促进发芽。
·支持平台:
1.M2测试平台：PVC支撑平台是由尺寸为56 × 36 × 1.2厘米，以适应试验槽的顶部。这些平台通过在两端粘上额外的PVC板（5 × 36 × 1.2厘米）而与试验槽顶部重叠2厘米（图4.1a）。M2筛选平台包含24个长方形隔间（6 × 7厘米），以1.2厘米的间隔定期切割。每个隔间可容纳100-200粒种子（对M2筛选有用）。尼龙网（防蝇网）被切割成适合PVC平台（56 × 36厘米），并用PVC-V胶水粘在下面。
2.M3和其他先进的代/线测试平台。这些PVC支撑平台的尺寸为36.5 × 26.5 × 1.2厘米。通过在两端加装一块PVC板（5 × 36 × 1.2厘米），使这些平台与试验槽重叠2厘米（图4.1c）。钻出圆孔（100个圆孔，直径2厘米）。两个这样的支撑平台可以放在一个大的试验槽上面。
3.回收水箱的支撑平台。PVC平台的尺寸为36.5 × 26.5 × 1.2厘米。通过在两端加装一块PVC板（5 × 36 × 1.2厘米），使其与水箱重叠2厘米（图4.1c, d）。在支撑平台（无网）上钻30个等距的开放孔（直径2.2厘米）。
·海绵条（10 × 2 × 1厘米）（图4.1d）。
·储备溶液的储存容器。可以制备少量的储备溶液，并在玻璃温室或室温下储存1-2个月；矿物沉淀或溶液中铁或铜等共价物的变化在这段时间内可以忽略不计。储存容器是不透气和不透光的，可以长期储存（1-2个月，图4.2）。Yoshida et al.（1976）对水稻水培的营养物质进行了描述，包括六种储备溶液（五种主要元素和第六种所有的微量元素）；为了方便，通常以5升的量配制（表4.1）。
•Yoshida氏工作溶液的储存桶:工作溶液是用六种储备溶液配制而成的，然后用蒸馏水在大桶中稀释。为方便起见，桶内可安装潜水泵，以帮助混合、通气和分配到水箱内。溶液可以新鲜制备，也可以储存起来，以便在下次调整pH值和体积时加入（每2天一次）。大量的Yoshida溶液（高达120升）可以储存在玻璃温室的密闭桶中，最多可储存1周。
•pH计。
•电导率仪。
注:蒸馏水是配制Yoshida溶液的首选，因为当地自来水可能会导致矿物质沉淀，并会改变矿物质浓度，从而影响盐敏感性。
4.2植物材料
测试材料应与已知耐盐性的标准基因型进行比较。奥地利塞伯斯多夫植物育种和遗传学实验室(PBGL)使用的标准如下:
•Pokkali: 耐盐的野生型
•Nona Bokra: 耐盐的野生型
•Bicol: 中等程度的耐盐性
•STDV：中等程度的耐盐性（来自IR29的诱导突变体）
•台北309：对盐敏感
•IR29:盐敏感
盐溶液培养中上述标准的耐盐性与田间表现相关(Gregorio et al. 1997; Afza et al. 1999)。根据标准材料转让协议，这些标准材料可以免费向IRRI索取。或者，已知耐盐性的当地栽培品种或育种品系可以用作标准。
4.3安装水培硬件
筛选工作在昼夜温度为30/20摄氏度、白天相对湿度至少为50%的温室条件下进行。温室应无病害，并采用自然或人工照明。水箱可以放在地板上或板凳上，但表面应该尽可能平整；水箱的水位也可以用楔子来调节。
4.5溶液培养溶液的制备
按照Yoshida 等 (1976) 的描述制备工作溶液。由Gregorio等(1997)改编。(表4.2)：每种原液摇动，将每种原液的150毫升样品混合在一起，制成120升。工作溶液的pH值在转鼓中用1 N氢氧化钠(NaOH)和1 N盐酸(HCl)调节至5.0，并进行连续搅拌(可使用泵)，以确保溶液均质；这同时使溶液通风。
4.6种子贮藏和种子催芽处理
种子应储存在干燥、密闭的容器中，温度为4摄氏度。在测试前应确定种子的萌发情况，因为种子必须均匀(以相同的速率)萌发，并且有足够的幼苗可供测试。有些种子样品可能有较高的种子休眠，这可以通过在40-50℃下加热2-5天来打破。种子样本也可能受到不同程度的微生物污染。这可以通过在0.8%次氯酸钠(NaClO)中浸泡20分钟，然后用水清洗三次的表面灭菌来控制。次氯酸钠溶液可以很容易地从商业漂白剂(约5%NaClO)中制成。这种处理甚至还能促进种子萌发。
4.7水培育苗技术
试验通常在温室中进行，日夜温度为30/20℃，湿度为70%，光周期为16小时。培养水箱中装满蒸馏水，直到水位超过筛网约1毫米。水位可以用楔子来调节。然后，种子被放入潮湿的隔间。对于M2筛选，每一穗上的30-50粒种子被放入一个隔室(6.7厘米)(图4.3a)；对于M3和高级品系测试，每隔室直径2厘米，放入5-10粒种子(或萌发的种子)；品系可以在箱内和箱之间复制(图4.3b)。然后用盖子盖住测试平台一周，以促进黑暗中的萌发。在第三天，用半强度的Yoshida液代替水，因为茁壮成长的幼苗需要营养。1周后，将萌发的种子转移到装有全强度Yoshida溶液的试验箱中，以便在盐处理之前建立健康的幼苗。幼苗生长到两叶阶段，在测试之前应该看起来绿色和健康。
注意:试验不应在不健康的幼苗上进行。
注意:如果种子样品不干净，在萌发过程中发生腐烂，则必须去除这些样品。种子在萌发前可在20%高乐氏溶液中浸泡20-30分钟，然后在蒸馏水中漂洗三次，从而对种子进行表面消毒。克洛昔布处理也有助于促进发芽。
4.8水培植物的护理
由于蒸发和蒸腾作用，会有溶液体积的损失和pH值的变化(藻类生长也可能导致pH值波动)。每两天(或一周三次)，需要将容积恢复到满负荷水平(接触平台隔室中的网)，并将pH值调节到5。溶液的更换可以通过提起平台，将它们暂时放在空的容器中，然后将溶液倒回一个桶中，在桶中，大体积的溶液可以在一个步骤中对整个实验进行pH调节。调整后，溶液被重新分配到测试槽中，幼苗平台返回。这些操作也起到给溶液通气的作用。或者，可以在单个水箱的基础上调节pH值，并且可以添加更多的工作溶液以补足每个水箱中的体积。
4.9盐处理
盐处理是在2-3叶期，在幼苗建立后1-2周在全强度Yoshida溶液中进行的(取决于成苗率，图4.3c)。盐处理是一次性应用的，而不是递增的。试验盐浓度为10dS/m(在1升Yoshida溶液和蒸馏水中，10dS/m分别相当于4.8g和6.4g氯化钠)。表4.3提供了Yoshida营养液(工作溶液)在Yoshida溶液中以克/升为单位的摩尔比和dS/m的换算。营养溶液(工作溶液)的大量盐化是通过在装有Yoshida的转鼓中加入干燥的氯化钠进行的，用潜水泵溶解和混合。加入盐，直到达到10dS/m；使用电导率仪(EC计)测量电导率。
4.10评分
盐分胁迫的目测症状是叶面积减少、下部叶片发白、叶尖死亡和叶片滚动。盐分筛选的技术是基于幼苗在盐化营养液中的生长能力。每个试验箱中通常包括标准基因型，以便进行比较。评分是相对的，根据IRRI开发的标准评价系统进行，1分代表耐受，9分代表敏感（表4.4）。评分在盐处理的第12天或前后进行。在这个阶段，敏感的幼苗开始死亡，而中间的基因型则表现出不同程度的耐受性（图4.3d）。表4.5给出了基于已知标准的耐盐性分类标准。
注：如果需要定量数据，可在处理的每一天进行评分。可以绘制生长曲线来研究不同时期的响应。为此，可以用芽/根/全株重量（鲜重和干重）、株高和分蘖来记录幼苗的生物量，这些都可以在随时间推移的定性评价中进行评分。然而，评分应在盐处理12天以上进行，因为此时易受影响的幼苗的生长减少最为明显，而耐受性强的幼苗显示出一些增长（但与对照幼苗相比减少）。
在盐处理的第12天，耐受性标准（Pokkali and Nona Bokra）表现出轻微的损害，叶尖变成褐色；中等耐受性标准（Bicol and STDV）表现出更多的叶片损害，老叶死亡，嫩叶仅在叶底呈绿色；易受影响的标准（IR29 and 台北309）已经死亡。
敏感品系将在敏感标准IR29的同一时间或之前死亡。
中等耐受性品系将以类似于Bicol的方式响应。
当Bicol开始死亡或已经死亡时，可以选择耐受线；这些线可以被移到回收槽中。
可以将选定耐性品系的症状与Pokkali进行比较，以估计耐性程度。
在没有标准品系的情况下，下表可用于评估苗木的耐受性(表4.5)。该表改编自《筛选水稻耐盐性》(Gregorio et al. 1997 )。
4.11耐盐品系的恢复
选定的耐性幼苗被从试验槽中梳理出来，并小心地保持根的完整。然后，将每个选定幼苗地上部分的底部轻轻地用海绵条(10×21×1厘米)包裹起来，并将幼苗插入回收槽中(图4.1d)。
经过挑选的幼苗可以在这些装满Yoshida溶液的水箱中成长到成熟，每两周更换一次。
a原子能机构题为“人力资源开发和核技术支助”的技术合作项目MYA/06031的研究金培训数据(Mr. Tet Htut Soe and Ms. Nacy Chi Win)
4.12例子
下表总结了PBGL对伊朗材料进行的幼苗水培筛选结果的盐度数据(表4.6)，缅甸(表4.7)和越南(表4.8)。
第五章 大麦和小麦耐盐性筛选方案
摘要
提出了一种测试小麦和大麦幼苗耐盐性的简单方法。该方法基于温室充气水培试验，在该试验中，将盐添加到生长幼苗的营养水培溶液中。提供了一份设备清单，包括水培硬件和库存解决方案。建议在使用前进行种子储存，并进行萌发前处理，以促进测试样品的萌发。盐处理在2-3叶期水培成苗后开始。盐分胁迫的视觉症状包括叶面积缩小、下部叶片发白、叶尖死亡、卷叶和幼苗死亡。给出了测试小麦和大麦的推荐测试盐浓度，以及恢复选定植株的方法。文中还给出了所用方案的实例。
5.1介绍
其他谷物，如小麦和大麦，则需要在水稻的试验方案上适当修改。种子萌发、水培通气和试验浓度都需要改变。小麦和大麦种子在水中不能很好地发芽，因此不能在水培平台中发芽。因此，种子萌发后，将幼苗转移到水培中。此外，小麦和大麦不能耐受厌氧生长条件，它们的根需要在水培中通气。此外，小麦和大麦比大米更耐盐，因此在较高浓度下进行测试。
5.2水稻方案对小麦和大麦的适应性
用0.8%的次氯酸钠预处理可以提高小麦和大麦的发芽率；这有助于对种子进行表面消毒，促进更多的同步发芽。次氯酸钠溶液可以很容易地从商业漂白剂（大约5%的NaClO）中制得。预处理包括将种子在0.8%的NaClO中浸泡20分钟，然后用水洗三次。种子（最多50粒）可以放在培养皿中湿润的滤纸上（每9厘米培养皿4毫升水，水不应该覆盖种子）。然后将培养皿放在4℃的黑暗环境中（冰箱）48小时；这种低温有利于均匀发芽。种子最好在夹层培养皿中发芽，这样可以产生垂直根系（图5.1）。将预处理过的种子放入夹层袋中，在室温（17-25℃）的条件下，将夹层袋放在一个放在水盘中的架子上。5-6天后，取出发育均匀的幼苗并放入水培。另外，可将培养皿中预处理过的种子转移到室温（17-25℃）的光照下再放置48小时，必要时补充水（当培养皿倾斜时，应该有大约1毫升的过量水）。在光照下4天后，发芽的种子应该有第一片叶子从叶柄中出现，并有3-8个根（图5.1b）。将这些幼苗单独取出，放在海绵圈内，插入水培系统中（图5.2a、b）。
5.2.1水培溶液
除了从水培开始就使用全强度的Yoshida溶液外，水培系统与水稻的描述相同。也可使用Hoagland溶液作为替代（这通常用于小麦和大麦的研究）（Hoagland and Arnon 1950）（表5.1）。
幼苗生长到两叶阶段，在测试之前应该看起来绿色和健康。
5.2.2通气
小麦、大麦和其他谷物在没有通气的情况下不能在水培中生长(水稻可以在没有通气的情况下生长，因为它有专门的通气根细胞)。曝气是通过将空气通过塑料管注入金属曝气杆来实现的。管子连接到中心环形管，环形系统提供均匀的压力；进料管安装在中心环上。进料管的末端装有20-30厘米长的钢管，钢管上打有小孔(直径约1毫米),让小气泡逸出(图5.3)。使用金属曝气管，因为它们沉入槽的底部，不会干扰根的生长。
我们推荐的一些方便的规格有:
•环形管:内径25毫米
•进料管:内径0.6毫米
•通气杆:内径0.6毫米
5.2.3温室条件
试验通常在温带作物温室中进行：20/15摄氏度(昼夜)，光周期为16小时。
通气杆可以由切割成一定长度的0.6毫米钢管制成，其一端通过夹紧密封。
有了这个系统，6-10个溶液培养水箱可以放在一个2×1 m的长凳上(图5.3c, d)。
幼苗一进入水培，就会被通气。
5.2.4测试盐浓度
作物对盐分的耐受性差异很大。小麦和大麦比水稻更耐盐。因此，使用不同的盐浓度用于其耐盐性测定。用于筛选小麦和大麦的典型浓度为15-20dSm-1或150-200 mmol NaCl，而用于筛选水稻的典型浓度为10dSm-1或100 mmoL。
盐处理中适合的的幼苗(在Hoagland液中的两叶阶段)可以直接将育苗盘转移到含有Yoshida溶液中测试NaCl浓度的水培箱完成。这是一步到位的方法。一种替代方法是以每天25毫摩尔的增量添加盐，直到达到测试浓度(这将减少渗透压差的影响)。
参考文献略
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